Processo de inclusão em parafina

Processo de inclusão em parafina para preparação dos cortes no micrótomo e uso nas lâminas de microscopia.

A parafina é imiscível com a água, que constitui os 70% dos tecidos animais. A primeira operação a fazer é tirar totalmente a água da peça fixada.

Isto pode parecer uma coisa muito simples, mas não é tanto assim. Para que as células e os tecidos mantenham a sua forma original, a água não deve ser simplesmente retirada, mas substituída por outro fluido.

O ideal seria um líquido que fosse miscível com a água e com a parafina, mas não há muitas substâncias que façam isso sem inconvenientes, por isso se utilizam duas fases: na primeira tira-se a água com um solvente e na segunda substitui-se este solvente por outro, miscível em parafina. O processo mais habitual utiliza o álcool 100% como primeiro solvente e o benzeno ou xilol como segundo.

A substituição da água por álcool 100% é um processo gradual: se pegarmos na peça do fixador aquoso e a atirarmos para dentro de um banho de álcool 100%, os tecidos vão-se deformar. A água vai ser extraída das células com violência, deformando-as e alterando as posições internas dos organitos (cada um dos elementos que constituem a célula), ou mesmo destruindo-os. É preciso, portanto, uma série de banhos com concentrações crescentes.

O volume

A substituição de água pela solução de desidratação é feita por difusão molecular. Isto quer dizer que o sistema tenta estabelecer um equilíbrio entre o conteúdo de água da amostra e do banho. Se o volume do banho não é consideravelmente superior ao da amostra, corre-se o perigo de que a concentração do banho fique alterada. Assim, o recipiente do banho deve ter um volume da ordem de 50 vezes o volume da amostra.

Rotina tradicional de desidratação com álcool e benzeno ou xilol

Rotina tradicional de desidratação com álcool e benzeno

Há muitas variantes desta sequência. As mais interessantes são as que incluem um líquido intermediário menos agressivo, como é o caso do dioxano, que substitui o álcool absoluto e o benzeno (os banhos que endurecem mais a peça), passando diretamente à parafina.

Inclusão em parafina

A parafina é uma mistura de diversos hidrocarbonetos saturados, às vezes com ceras. É quimicamente inerte, solúvel em diversos solventes orgânicos, com baixo ponto de fusão, e fácil de cortar com uma faca, o que faz dela um bom meio para inclusão.
Há parafinas de diversos pontos de fusão. Quanto mais elevado é o ponto de fusão, mais dura é a parafina. Em geral utilizam-se parafinas que fundem entre os 50°C e os 70°C.

Impregnação

A amostra é mergulhada na parafina fundida numa estufa ou banho-maria a uma temperatura alguns graus acima do ponto de fusão da parafina. O tempo de permanência na parafina fundida depende de vários fatores:

a. Líquido intermediário: quanto mais volátil seja o líquido intermédio, mais depressa sai da peça para ser substituído pela parafina líquida. Assim, o benzeno, que é mais volátil que o xileno, precisará de menos tempo para impregnação. A essência de cedro, pelo contrário, exigirá mais tempo de impregnação.
b. Natureza e tamanho da amostra: Dependendo do tipo de tecido, será preciso mais ou menos tempo. O tamanho tem o mesmo efeito para a fixação.

Será preciso determinar o tempo necessário de um modo mais ou menos empírico. Serão precisos, como na desidratação e líquidos intermediários, três banhos. O tempo pode ir desde algumas horas, para o pâncreas de um vertebrado, até três dias para a cabeça de um inseto grande.

Confecção do bloco

Montagem da parafina 01

Para construir o bloco é preciso utilizar um molde.
Um sistema clássico é o dos esquadros de Leuckart. Estão representados na figura. São duas peças de metal em forma de L, que permitem deixar entre elas uma cavidade maior ou menor, segundo a sua posição.

Montagem da parafina 02

Para utilizá-los, colocam-se sobre uma base de vidro ou de metal e se dispõem um contra o outro, de modo a deixar entre eles, uma cavidade suficiente para o tamanho do bloco que se deseja construir.

Montagem da parafina 03

A seguir (as operações devem ser efetuadas com rapidez), derrama-se parafina limpa fundida no molde formado e se coloca a peça no interior da parafina, utilizando pinças aquecidas. Deve-se ter o cuidado de orientar a peça na posição correta para o corte. Para isto poderão ser de utilidade umas agulhas de dissecção previamente aquecidas.

Montagem da parafina 04

Depois de alguns segundos a parafina começa a solidificar. Nesse momento o conjunto dos esquadros e a base devem ser mergulhados em água fria e deixados nela uns minutos, para que a parafina solidifique depressa, sem formar cristais que diminuam sua homogeneidade.

Agora, pode se retirar os esquadros que fizeram o molde e extrair o bloco formado.

Etiquetagem

Um dos problemas da histologia é a correta identificação das peças. O processo mais seguro para a maioria dos casos, é atribuir um número a cada peça, registre num livro (caderno diário do laboratório) ou base de dados no computador onde consta a descrição, data, técnicas utilizadas, etc.

Montagem da parafina 05

Este número é escrito com lápis num papel de boa qualidade, que vai acompanhar a peça ao longo de todo o processo de preparação, mergulhando, com ela nos fixadores, lavagens, líquidos desidratantes, intermediários e parafina. Este método não é viável quando são utilizados fixadores com ósmio, porque o papel fica completamente preto, sendo impossível ler o número escrito. Nesse caso, o papel terá de fazer o seu percurso fora dos frascos. Não é preciso dizer que se deve ter cuidado redobrado para evitar o seu extravio ou deterioração.

Este papel pode, finalmente, ser aderido a um lado do bloco solidificado, pincelando com um pouco de parafina fundida.

Entalhe do bloco

Montagem da parafina 06

A última operação antes do corte pelo micrótomo é o entalhe do bloco. Utilizando um estilete ou uma lâmina, cortar como uma pirâmide: o topo será a face de corte. É costume frisar uma das quinas, isso ajuda a orientar o corte na sua colocação e distensão na lâmina do micrótomo.